# Supplementary: Effect of $15 \mathrm{sec$ Exposure of Commercial Hand Sanitizers on Inactivation of Viruses
}

増川 克典**, 白石 晶子**,***, 田中 紀行 ${ }^{* *, * * *}$, 藤井 健吉 ${ }^{* *, * * * *}$
Yoshinori MASUKAWA, Akiko SHIRAISHI, Noriyuki TANAKA and Kenkichi FUJII
}

\begin{abstract}
An effect of commercial hand sanitizers containing ethanol (EtOH) combined with benzalkonium chloride (BC) on inactivation of Influenza A virus (IAV) and SARS-CoV-2 was investigated under conditions of exposure time $15 \mathrm{sec}$, to supplement our previous article reporting the testing results of the inactivation under exposure for $30 \mathrm{sec}$. All the results tested showed more than $4 \log _{10}$ reduction for IAV and SARS-CoV-2. The results demonstrated that, under conditions of the shorter exposure, close to the real rubbing usage, the commercial hand sanitizers containing low-concentrated EtOH (44-65 vol\%) combined with $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC}$ are effective to inactivate IAV and SARS-CoV-2.
\end{abstract}

Key Words: hand sanitizer, ethanol, Benzalkonium chloride, Influenza A virus, SARS-CoV-2

手指消毒における感染リスク低減とQOL向上 を両立すべく，エタノール $(\mathrm{EtOH})$ と塩化ベンザ ルコニウム $(\mathrm{BC})$ を組合わせた手指消毒剤の $\mathrm{EtOH}$濃度低減の可能性についてEN14476試験手順に 従い 30 秒暴露で検討した内容を前報にて報告し た(増川ら，2022）。その補足として15秒暴露の 試験データを取得したので本レターにて追記す る。

COVID-19パンデミック宣言(WHO，2020) 以来,市中感染リスクを低減するための対策として手指消毒が重要となっている。高濃度(76.9-81.4 vol\%) EtOHを含む手指消毒剤はエンベロープウイルス 不活化に高い効果を有する一方，肌刺激や流通性 の点から QOLに課題を有する。生活者が日常生活の中で接触感染リスクを低減でき且つより良い QOLを実現するために，EtOHと BCを組み合せ
た手指消毒剤を検討し，20-50 vol\%の低濃度 $\mathrm{EtOH}$ と $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \quad \mathrm{BC}$ を組合せた手指消毒剤に よってインフルエンザAウイルス (IAV)及び SARS-CoV-2を相乗的に安定的に不活化し得るこ とが分かった (増川ら, 2022)。その際の不活化試験は 30 秒暴露で実施した。欧州統一規格 EN14476 (CEN, 2019)では手指消毒剤のウイルス 不活化試験を 30 秒-120秒のいずれかの暴露時間 で行うことが明示されており，EN14476で設定さ れた最低暴露時間 30 秒が妥当と判断したからで あった。実際にEN14476に基づいたウイルス不活化試験の多くが 30 秒乃至 60 秒の暴露で実施さ れている(Ijaz et al., 2021; Leslie et al, 2021; Herdta et al., 2021)。一方WHOは10秒-15秒以上擦り込む こと(WHO, 2009), CDCは20秒程度擦り达むこと (CDC, 2022)を手指消毒の実践として推奨してい


る。Choi et al. (2021) は手指消毒剂使用者におけ る擦り达み時間の実態調查に基づき, COVID-19 発生によって手指消毒剂を用いた手指消毒行動の 頻度が上甼し, その擦り込み時間として 10 秒が 最も多く(最頻値)，20 秒・30秒の使用者も見ら れると報告している。つまりEN14476のガイド ライン試験法では 30 秒以上の暴露が設定されて いるが，WHO/CDCは30秒を下回る擦り达みを 推奨しており，多くの生活者の実態もその推奖に ほぼ一致するものであった。そこで，今回 15 秒暴露でウイルス不活化試験を行い，前報の30秒暴露の結果（増川ら，2022）を補足すべきとの考 えに至った。実態により近い 15 秒暴露の試験結果が手指消毒の科学を深めるとともに，一般の生活者が感染リスクに晒される市中感染の対策とす るために有用な情報になると期待されたからで あった。

試料としては，前報（増川ら，2022）と同様に 以下の市販手指消毒剤（指定医薬部外品）を用い た。製剂 $\mathrm{A}$ (花王株式会社, 商品名: ビオレガー ド薬用泡で出る消毒液『, 薬事販売名: ビオレ ガード薬用消毒フォーム, 有効成分 $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \%$ $\mathrm{BC}, 44 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH}$ ), 製剂 $\mathrm{B}$ (同社，商品名：ビオ レガード薬用消毒タオル ${ }^{\circledR}$, 薬事販売名：ビオレ ガード薬用消毒タオル，有効成分 $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \quad \mathrm{BC}$ ， $54 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH}$ 含有), 製剤 C(同社, 商品名：ビオ レガード薬用消毒シート ${ }^{\circledR}$, 薬事販売名：ビオレ ガード薬用消毒シート，有効成分 $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \quad \mathrm{BC}$ ， $52 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH}$ 含有), 製㓣 D(同社, 商品名：ビオ レ 藥用手指の消毒液 ${ }^{\circledR}$, 薬事販壳名：ビオレu 薬用手指の消毒液, 有効成分 $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \quad \mathrm{BC}$, $65 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH}$ 含有), 製剤 $\mathrm{E}$ (同社, 商品名：ビ才 レガード薬用手指消毒スプレー『，薬事販売名： ビオレ ガード薬用手指の消毒液 $\mathrm{s}$, 有効成分 $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC}, 65 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH}$ 含有)，製剂 $\mathrm{F}$ (同社,商品名：ビオレガード薬用手指消毒スプレー $\alpha^{\circledR}$,薬事販壳名：ビオレ ガード 薬用手指の消毒液，有効成分 $79.7 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ 。な扮製剂 B及び 製剤Cについては，前報（増川ら，2022）同様に 絞り液中の BC 及びEtOHが含浸前仕达久液と同一濃度であることを確認した上で絞り液を試験に用 いた。

ウイルス不活化効果試験は, EN14476:2013+ A2：2019の定量的懸濁試験手順 (CEN，2019）に基 づき, IAV (H1N1, A/Puerto Rico/8/34株, ATCC VR-1469）及びSARS-CoV-2（TY11-927）に対する殺ウイルス活性を暴露時間 15 秒で調べることに よって実施した。最小必須培地に懸濁したウイル ス液, $3 \mathrm{~g} / \mathrm{L}$ ウシ血清アルブミン (BSA)水溶液,試験溶液を $1: 1: 8(\mathrm{v} / \mathrm{v} / \mathrm{v})$ の比率にて $22^{\circ} \mathrm{C}$ で混合 し, 15 秒後に細胞培地溶液を 10 倍希釈して反応停止した。IAVでは反応溶液の3 倍希釈系列を MDCK 細胞（イヌ腎臟由来細胞，JCRB9029）に 添加し1時間吸着させた。SARS-CoV-2ではVero E6 細胞 (TMPRSS2 JCRB 1819) に添加し1 時間吸着させた。IAV, SARS-CoV-2ともに, 細胞培地で 洗浄し $5 \% \mathrm{CO}_{2}, 37^{\circ} \mathrm{C}$ で 4 日間培養した後, $50 \%$ 組織培養感染量 $\left(\mathrm{TCID}_{50}})$ 法でウイルス感染力価を測定した。いずれの試験においても繰り返し測定を 行い, 対照である滅菌蒸留水の試験結果との差分 を不活化量 $\left(\log _{10} \mathrm{TCID}_{50} / \mathrm{mL}})$ とした。な打本試験 と同倍に希釈した製剤が宿主細胞に対して細胞毒性を示さなかったことを付記しておく。

6 種市販消毒剤（製剂 A-F）で 15 秒暴露した際 のIAV 及びSARS-CoV-2の不活化試験結果をそれ ぞれTable 1 及びTable 2 に示す。いずれの製剂に おいても 15 秒暴露によって $4 \log _{10}$ 以上の不活化量を示した。この結果は, 指定医薬部外品の外皮消毒剤(MHLW, 1999) として認可され得る76.9$81.4 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH}$ (有効成分) より低濃度の $\mathrm{EtOH}$ (製剂 A: 44 vol\%, 製剂 B: 54 vol\%, 製剂 C: 52 vol\%, 製剂D及び $\mathrm{E}: 65 \mathrm{vol} \%$ ） $0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC}$ (有効成分) と組み合わせることによって，30秒より短い 15 秒でもIAV及びSARS-CoV-2を $99.99 \%$ 以上不活化 することを意味する。多くの生活者が 30 秒に満 たない短い時間で手指消毒を行っていること (Choi et al., 2021)を照らし合わせれば，製剤 A-F は実使用に近い暴露時間でも十分にIAV及び SARS-CoV-2を不活化すると理解された。

前報（増川ら，2022）の30秒暴露及び今回の 15 秒暴露の試験結果の捉え方について述べる。 ウイルス不活化試験の国際ガイドライン EN14476 の基準に基づけば，手指消毒剤のウイルス不活化 に対する有効性は 30 秒-120秒の暴露において 4 $\log _{10}$ の不活化量を示すこととされており (CEN, 2019)，30秒より短い 15 秒の暴露は EN14476の範囲外である。従って手指消毒剤の 15 秒暴露の試験結果はEN14476の基準に適合した 30 秒暴露の 試験結果（増川ら，2022）の参考データに位置づ けられる。もち万ん 15 秒暴露で $4 \log _{10}$ 以上を不活化するのであれば 30 秒暴露での $4 \log _{10}$ 以上の 不活化も容易に類推されるが，厳密にEN14476

Table 1 Inactivation of Influenza A virus (IAV) for exposure time $15 \mathrm{sec}$ by commercial hand sanitizers containing ethanol $(\mathrm{EtOH})$ and benzalkonium chloride $(\mathrm{BC})$

 &  &  \\

製剂 $\mathrm{B}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 54 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.48 & 2.88 & 4.60 \\
製剂 $\mathrm{C}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 52 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.48 & 2.76 以下 & 4.71 以上 \\
製剤 $\mathrm{D}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 65 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.48 & 2.76 以下 & 4.71 以上 \\
製剂 $\mathrm{E}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 65 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.48 & 2.76 以下 & 4.71 以上 \\
製剤 $\mathrm{F}(79.7 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.48 & 2.76 以下 & 4.71 以上 \\

${ }^{a}$ 滅菌蒸留水を用いた同条件の試験結果

${ }^{\mathrm{b}}$ 時間 15 秒, 温度 $22^{\circ} \mathrm{C}, 0.3 \%$ ウシ血清アルブミン負荷

c (株) 中部衛生検査センターによる試験

Table 2 Inactivation of SARS-CoV-2 for exposure time $15 \mathrm{sec}$ by commercial hand sanitizers containing ethanol (EtOH) and benzalkonium chloride ( $\mathrm{BC}$ )

 &  &  \\

製片 $\mathrm{B}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 54 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.12 & 2.76 以下 & 4.36 以上 \\
製片 $\mathrm{C}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 52 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.12 & 2.76 以下 & 4.36 以上 \\
製片 $\mathrm{D}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 65 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.12 & 2.76 以下 & 4.36 以上 \\
製片 $\mathrm{E}(0.05 \mathrm{w} / \mathrm{v} \% \mathrm{BC} / 65 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 7.12 & 2.76 以下 & 4.36 以上 \\
製剤 $\mathrm{F}(79.7 \mathrm{vol} \% \mathrm{EtOH})$ & 8.07 & 3.24 & 4.83

a 滅菌蒸留水を用いた同条件の試験結果

${ }^{\mathrm{b}}$ 時間 15 秒，温度 $22^{\circ} \mathrm{C}, 0.3 \%$ ウシ血清アルブミン負荷

c(株) 中部衛生検査センターによる試験

に従うかという点で判断すれば基準外と評価され る。COVID-19以降，未曽有の感染症によって世界が震撼し，市中感染対策の新たな社会リスクが 可視化され，一般生活の場面でも特に水が使えな いケースで市販手指消毒剤が頻繁に使われるよう になってきた。これは市中感染対策の 1 つとして 消毒の専門的な教育・訓練を受けていない一般の 生活者が日常生活で手指消毒剂を用いるように なってきたことを意味する。現状の 30 秒 -120 秒 より短い暴露時間（15秒暴露）が国際ガイドラ イン試験法EN14476に含まれれば，多くの生活者の手指消毒実態に近い試験条件となり，WHO 推奨の 10 秒 -15 秒以上 (WHO, 2009) や CDC 推奨の 20 秒程度 (CDC，2022) にも整合してくる。アフ ターコロナの季節性インフルエンザや将来懸念さ れるCOVID-19クラスの Disease-Xパンデミック 等の感染症リスクに備える社会制度として, 生活者の実使用に近い条件（15秒暴露）を国際ガイ ドライン基準へ追加すべきであろう。

低濃度 EtOHと BCを組合わせた市販手指消毒剂によって手指を介する接触感染リスクを低減し ながら QOL向上に貢献できるという前報の結論 （増川ら，2022）は変わらない。一般の生活者が 手指消毒剤を用いる実使用に近い 15 秒暴露条件 においても低濃度 EtOHと BCの組合わせによっ てIAV やSARS-CoV-2を $4 \log _{10}$ 以上不活化できる ことを追記した。前報（増川ら，2022）及び本レ ターの内容がCOVID-19パンデミックによって顕在化されたウイルス市中感染リスクの低減に対し て有効に活かされれば幸いである。
## 謝辞

本論文の作成に当たり，IAV試験の条件設定に花王株式会社森卓也氏, 早瀬温子氏, 高田郁美氏，試験結果の解釈に関して花王株式会社山本哲司氏に，それぞれのご専門の視点から貴重なご助言をいただきました。（株）中部衛生検査センター のご協力のもとで本試験を実施しました。また，査読者の先生に有意義なご指摘を頂いた上で完成できました。ここに記して御礼申し上げます。

## 参考文献

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