# 遺伝医学アップデート：基礎医学から臨床現場まで

（2）脳動脈瘤の感受性遺伝子の解析

東京女子医科大学総合医科学研究所
東京女子医科大学足立医療センター脳神経外科
$\begin{array}{ll}\text { アカガワ } & \text { ヒロュキ }
\text { 赤川 浩之 }\end{array}$
}

（受理 2023 年 1 月 19 日）
## Genetic Medicine Update: From Basic Research to Clinical Care (2) Genetic Susceptibility to Intracranial Aneurysms

\author{
Hiroyuki Akagawa \\ Institute for Comprehensive Medical Sciences, Tokyo Women's Medical University, Tokyo, Japan \\ Department of Neurosurgery, Tokyo Women's Medical University Adachi Medical Center, Tokyo, Japan
}

Intracranial aneurysms (IA) cause subarachnoid hemorrhage (SAH), which has high mortality and morbidity rates when rupture occurs. The success of genome-wide association studies (GWASs) followed by phenotypic confirmation in transgenic mice has supported the implication of genetic factors in the formation of IA. For example, a Sox17-deficient mouse model was established based on previous GWAS findings, confirming the development of IA resulting in SAH following Sox17 deficiency. The most recent international GWAS identified over half of the disease heritability of IA, including 17 risk loci using more than ten thousand patients. The remaining proportion of heritability, the so-called missing heritability, can be explained by the effects of rare variants detected by next-generation sequencing (NGS). In this review, we discuss the current knowledge regarding genetic factors associated with IAs provided by GWAS and rare variant analysis using NGS.

Keywords: intracranial aneurysm, susceptibility gene, genome-wide association study, next-generation sequencing, rare variant

## はじめに

脳血管疾患は，1951 年より 1980 年まで本邦の死因の第 1 位であった。近年は肺炎や老衰の割合が増加して第 4 位とはなったものの, 依然として悪性新生物や心疾患と並び，我々の生命を脅かす主要な疾患の座にとどまり続けている¹).いわゆる“三大疾病” のうちの一つである.このうち特に死亡率が高いこ
とで知られているのがクモ膜下出血であり, そのお よそ $85 \%$ が脳動脈瘤の破裂に起因する ${ }^{2}$. 脳動脈瘤 は, 他の多くの脳血管疾患と同様, 複数の遺伝的要因と環境要因が相互に作用して発症に関わる多因子疾患である。本邦では脳の画像検査を受けた人の 6〜7\% で診断される“ありふれた疾患 (common disease)”である ${ }^{3)}$. 危険因子（環境要因）として喫煙習

Corresponding Author: 赤川浩之 〒 162-8666 東京都新宿区河田町 8-1 東京女子医科大学総合医科学研究所 akagawa. hiroyuki@twmu.ac.jp

doi: $10.24488 /$ jtwmu.93.2_49

Copyright (C) 2023 Society of Tokyo Women's Medical University. This is an open access article distributed under the terms of Creative Commons Attribution License (CC BY), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original source is properly credited.
慣と高血圧症が最も主要なものとして挙げられ，脳動脈瘤が診断された場合は禁煙と降圧療法が推奨さ れる。一方，遺伝的要因は，しばしば聴取される家族歴によっても実感され， 1 親等以内の脳動脈瘤保有者の家族歴がクモ膜下出血をきたす危険因子とも なっている2).これを支持する定量的指標として，破裂脳動脈瘤によるクモ膜下出血患者の第 1 度近親者 の相対危険率は 4 倍, 同胞の場合は相対危険率 6 倍 と報告されている). さらに, 脳動脈瘤の遺伝的要因 の証左として, 脳動脈瘤を合併する遺伝性疾患の存在も挙げられる。常染色体顕性多発性囊胞腎 (autosomal dominant polycystic kidney disease: ADPKD)，マルファン症候群，エーラス・ダンロス 症候群など様々な遺伝性疾患との合併の報告がある が,このうち ADPKD が最も脳動脈瘤と関連がある 遺伝性疾患であり，ADPKD 患者は一般人口に比し 有意に脳動脈瘤保有率が高い (12.4\%) ことが示され ている ${ }^{45)}$.このような遺伝的要因を背景にこれまで 様々な遺伝子解析が行われてきたが，本稿では近年 のハイスループット解析技術によりもたらされたゲ ノムワイド関連解析 (genome-wide association study：GWAS）の成果，そこから浮かび上がってき た課題と次世代シーケンシング解析による成果，そ して今後の展望について概説する。

## ゲノムワイド関連解析（GWAS）

もはや多因子疾患の遺伝子解析ではゴールドス夕 ンダードとして広く認知されている手法である。こ れまで様々な形質で実施されてきた 5,000 を超える 研究が，米国立ヒトゲノム研究所と欧州バイオイン フォマティクス研究所の共同運営によりGWAS Catalogueとしてデータベース化されている  ${ }^{6}$. 脳動脈瘤におい ては，2008 年に米国 Yale 大学を中心とした研究グ ループによって初めての GWAS が行われたて). 同グ ループはさらにサンプルサイズを増やした検討も継続し, 最終的にはヨーロッパ人や本学の日本人サン プルを含む患者 5,891 例と対照 14,181 例に及ぶ解析 となっだ ${ }^{8}$. 再現性の高い主要な遺伝子として， CDKN2A-CDKN2B 遺伝子領域 $(9 \mathrm{p} 21.3 ; \mathrm{p}=1.5 \times$ $10^{22}$, オッズ比 1.31) やSOX17 遺伝子 (8q11.23$\mathrm{q} 12.1 ; \mathrm{p}=1.3 \times 10^{-12}$,オッズ比 1.28 ）などが特定さ れている。さらに同グループは，日本人患者に注目 したサブ解析により，染色体 $4 \mathrm{q} 31.22-\mathrm{q} 31.23$ の EDNRA 遺伝子も特定した $\left(\mathrm{p}=2.2 \times 10^{-8}\right.$, オッズ比 $1.22)^{9}$.この ENDRA 遺伝子は後にバイオバンク・
ジャパンにより報告されたGWAS（日本人患者 1,048 例, 対象 7,212 例）によっても再現性をもって 検出されている $\left(\mathrm{p}=9.6 \times 10^{-9}\right.$, オッズ比 1.25$)($ Table 1 ${ }^{10}$. GWAS の隆盛とともにデー夕解析に係る 遺伝統計学的手法も洗練されていった. 世界の様々 な人種における一塩基多型 (single nucleotide polymorphisms : SNPs) や連鎖不平衡地図のデータベー スも整備され，SNPアレイのデータから実際には ジェノタイピングされていない SNPS 遺伝子型を高精度に決定することも定型的に行われている（imputation 法).これによりプラットフォームの異なる SNPアレイで取得したデータを無駄なく統合する ことが可能となり, GWAS は多数の研究機関が参画 する大規模メ夕解析へと発展していった. 脳動脈瘤 では 2020 年に国際脑卒中遺伝学コンソーシアムや 本邦のバイオバンク・ジャパンなど多数の研究機関 が参画した大規模解析の結果が報告された。患者 10,754 例と対照 306,882 例に及ぶ解析がなされ, 前述の CDKN2A-CDKN2B 遺伝子領域, SOX17 遺伝子 や EDNRA 遺伝子の関連が再現されたほかに 14 種 の遺伝子が検出され,これら合計 17 種の遺伝子で脳動脈瘤の遺伝力 (heritability) の搞よそ半分を説明で きる成果となった ${ }^{11}$. 本稿では再現性, 日本人患者の 解析, そして機能解析の有無という観点で前述から 例示している代表的な 3 種の遺伝子領域を染色体番号順に取り上げて解説する。

## 1. EDNRA (4q31.22-q31.23)

日本人患者に注目した 2 つの別個な研究で再現性 をもって検出された座位である ${ }^{910)}$. 関連 SNP は EDNRA 遺伝子上流の発現調節領域に位置してい る. 塩基置換によりDNA 結合蛋白との親和性が変化し, 遺伝子発現を減弱させることも示されてい る $^{10}$. EDNRA は血管平滑筋に発現する $\mathrm{A}$ 型エンド セリン受容体をコードしている。リガンドであるエ ンドセリンは強力な血管収縮因子として生理的機能 を担う一方で, 高血圧症やアテローム性動脈硬化な どの発症にも深く関与している ${ }^{122}$. エンドセリン経路の抑制は血管壁修復作用を抑制するといわれてお り，A 型エンドセリン受容体の拮抗薬を投与した動物モデルでは，冠動脈に動脈瘤様の変化が起きるこ とも報告されているる ${ }^{1314)}$

## 2. $\operatorname{SOX17(8 \mathrm{q} 11.23)$}

SOX17 は SOX [sex-determining region Y (SRY)related high mobility group (HMG) box] 遺伝子ファ ミリーに属する転写因子である。 マウス Sox17 は胎

Table 1. A summary of previous genome-wide association studies of intracranial aneurysms.

 & Locus &  & Gene &  & $\mathrm{p}$-value \\

CI, confidence interval; NA, not available.

子および成体の動脈血管内皮細胞に強く発現してお り，血管構築やその維持に重要な役割を果たしてい ることが知られている ${ }^{15}$. GWAS の結果を受けて血管内皮細胞特異的なSox17 久失マウスが樹立され，高血圧ストレス下において脳動脈瘤が形成されるこ とが確認されている ${ }^{16}$.

## 3. CDKN2A-CDKN2B 遺伝子領域 (9p21.3)

癌抑制遺伝子としてよく知られる $C D K N 2 B$ およ び CDKN2A 遺伝子のテロメア側近傍に存在する領域である. GWAS 黎明期より 2 型糖尿病, 心筋梗塞 や腹部大動脈瘤など複数の多因子疾患との関連が相次いで報告された興味深い座位である。 その後の研究で, $C D K N 2 B, C D K N 2 A$ 遺伝子の発現調節に関与 している non-coding RNA である CDKN2BAS 遺伝子(別 名 antisense non-coding RNA in the INK4 locus：ANRIL)に相当することが明らかにされだを.17188.相同領域を欠失させたマウスでは, 大動脈平滑筋細胞の Cdkn2a, Cdkn2bの発現が減少し細胞増殖が元進することが確認されている ${ }^{19}$.

## 次世代シーケンシング（NGS）による レアバリアント解析

遺伝力 heritability のかなりの部分を特定できた のはGWASによる大きな成果である。かねてより 想定されていた病態（血管平滑筋細胞や内皮細胞の 障害）と矛盾しない遺伝子が捉えられ，さらには SOX17のようにGWAS で同定された感受性遺伝子 の改変によって脳動脈瘤モデル動物も確立されるに 至った ${ }^{16}$. しかしその一方で, 大規模 GWASによっ ても検出しえない遺伝力, いわゆる“missing heritability”の存在が強く認識されるようになった20).

GWASでは一般人口での対立遺伝子頻度が高い SNPs が解析対象となるため, 統計学的に強固な感受性 SNPs が特定されてもその効果サイズは小さい

(Figure 1). Table 1 でも示した通り脳動脈瘤では オッズ比にして1.2 1.36 程度である. 多型よりも低頻度のバリアント（対立遺伝子頻度 $0.5 \%$ に満たない レアバリアント）に効果サイズの高い未知の遺伝要因が存在すると考えられてきたが，次世代シーケン シング (next-generation sequencing：NGS) の登場

Modified from Manolio TA, et al. Nature. 2009;641:747-53, and Tsuji S, et al. Hum Mol Genet. 2010;19:R65-70.

Figure 1. Risk allele frequency and strength of genetic effect.

GWAS, genome-wide association study; SNPs, single nucleotide polymorphisms.

Figure 2. Japanese multiplex families with intracranial aneurysms.

によりこのような疾患感受性レアバリアントの探索 が可能な時代が到来した ${ }^{21)}$ レアバリアントが関連 する感受性遺伝子では，種類が異なる複数の病因性 レアバリアントが総和として患者群に多く観察され るというパターンが最も想定されるが, 疾患発症に 対して中立のレアバリアントやプロテクティブに働 くレアバリアントも存在するため, GWAS とは異な る特別な遺伝統計学的アプローチも必要となる22).以下に我々が報告したレアバリアント関連解析を実例として紹介する。

我々は脳動脈瘤患者のゲノム DNA サンプリング に際し, 特に第 1 度近親者に家族歴を有する家族性脳動脈瘤患者に注目して血縁罹患者の収集に努めて きた。 そのなかで 3 世代にわたって 7 人の患者を生 じた大家系 F2054 に注目し (Figure 2), 世代 III の 6 姉妹および世代 IV で生じた患者の計 7 例で全 エクソーム・シーケンシングを実施した．有害なレ アバリアントが罹患者 4 人で共有される候補遺伝子 が 7 個検出されたが，そのうち特にバリアントの有害度の指標が最も高かったNPNT (Nephronectin) と CBY2 (Chibby family member 2) 遺伝子に着目した (Table 2).NPNT は細胞外マトリク スのネフロネクチンをコードし，インテグリン $\alpha 8 /$ $\beta 1$ の機能的なリガンドとして腎臟の発達に欠かせ

Table 2. Overview of seven representative candidate genes identified from the F2054 family.

} & \multirow{2}{*}{} & \multicolumn{7}{|c|}{ Genotype } & \multirow{2}{*}{} & \multirow{2}{*}{} \\

IBD segment, identity by descent segments were calculated from the SNP array data using Beagle version 3.3; CADD, C-scores of the combined annotation dependent depletion version 1.2. None of the listed variants was observed in our 105 Japanese populationbased controls.

Figure 3. Minigene splicing assay of the c.1515+1G>A variant in NPNT.

ないほか, いくつかのインテグリンを結びつけて細胞接着にも関与する. NPNT の異常は血管内皮機能 に影響し, 正常な血管新生が阻害されることも報告
されている ${ }^{23}$. 今回 NPNT で検出されたスプライス ドナー部位 c. $1515+1 \mathrm{G}>\mathrm{A}$ を minigene assay で解析したところ，異常なスプライシングを引き起こし

Peripheral cerebral artery

## Ruptured cerebral aneurysmal wall

Figure 4. Immunohistochemical analysis of cerebral arterial specimens. HE, hematoxylin eosin.

て第 10 エクソン全体の skipping をきたすことが確認された(Figure 3)。一方, CBY2 は遺伝子発現デー タベースによれば，主に精巣で発現し，次いで脳で も発現が見られることが示されていた。しかし，こ れまでにヒトの疾患との関わりが全く報告されてお らず疾患遺伝子としては新規分子であったため, ょ り詳細に検討を行った. 免疫組織学的検討では脳血管平滑筋に発現しており (Figure 4), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) に よっても isoform 2 特異的に脳血管平滑筋細胞に発現していることを確認した. CBY2 に赤色蛍光タグ を付加して COS7 細胞に強制発現させたところ，患者から検出されたミスセンス変異 p.Pro83Thrでは 細胞質内での異常凝集が観察された (Figure 5). 立体構造解析ではアミノ酸置換により周辺の $\beta$ シー 卜構造が伸長して凝集モチーフを獲得するとの計算結果が得られ，培養細胞実験結果を支持した。この p.Pro83Thr バリアントは他の脳動脈瘤家系 F2012 からも検出されていたため (Figure 2), 追加脳動脈瘤患者 499 例, 対照 323 例を用いて CBY2 全域のリ
シーケンシングを行った. その結果, 3 種類の有害な レアバリアント (p.Arg46His, p.Pro83Thr, p.Leu $183 \mathrm{Arg}$ ）が患者特有に検出され有意な関連を示した (患者合計 $8 / 501$, 対照合計 $0 / 323, p=0.026$ ) (Table 3)，以上より，脳動脈瘤家系 F2054 では新規感受性遺伝子 NPNT と CBY2 のレアバリアントが，それぞ れ脳血管内皮および平滑筋細胞の機能障害を惹起し て脳動脈瘤の発生に寄与したと考えられた，家族性脳動脈瘤は同一家系であっても複数の遺伝要因で発症し, その遺伝背景は多様で家系によって大いに異 なることも示唆された24.

このような NGSを用いたレアバリアント解析は 欧米からの研究報告も散見されており，もやもや病 の感受性遺伝子として知られる RNF213 遺伝子や循環血管新生誘導因子をコードする ANGPTL6 遺伝子 のレアバリアントとの関連などが報告されてい $る^{2526)}$. 互いに検証し合いながら知見を蓄積していく ことが重要である.

## おわりに

多因子疾患では大規模 GWAS が進み，特定され

A

Figure 5. Immunofluorescence imaging of CBY2-expressing COS7 cells.

Table 3. Association analysis with rare sequence variants in $C B Y 2$.

} & \multirow[b]{2}{*}{} & \multirow[b]{2}{*}{} & \multicolumn{3}{|c|}{ No. of detected subjects } & \multirow[b]{2}{*}{ SIFT } & \multirow[b]{2}{*}{} \\

Burden association tests were performed using a two-tailed Fisher's exact test.

た多数の遺伝要因を使って個人の疾患リスクをスコ ア化 (polygenic risk score : PRS) する研究が精力的 に進められている。個人のゲノム情報は生涯不変の ため, 算出された PRS も不変であり, 様々な生活習慣病に対する易罹患性予測や薬剤効果，副作用予測 に大きな効果が期待できる。予測により早期に行動変容すれば疾患発症を阻止，遅延させうることもで きるだろう。より高精度な PRS を構築するために， さらに大規模な GWAS（100万人规模）を目指す考 えや，レアバリアント情報を組み达む取り組みも行 われている ${ }^{2728)}$. 今後の動向を注視したい.開示すべき利益相反はない。

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\text { 文 献 }
$

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Tokyo Women's Medical University