# 循環系の基礎と臨床

(2) 血管新生

東京女子医科大学輸血・細胞プロセシング科
ウッギサワ 多イ゙ュュ・䕉 大樹・菅野仁
（受理 平成 29 年 3 月 24 日）
## Circulatory System: Basic and Clinical Research \\ (2) Neovascularization
}

## Taiju UTSUGISAWA and Hitoshi KANNO

Department of Transfusion Medicine and Cell Processing,

Tokyo Women's Medical University, Faculty of Medicine

Neovascularization consists of three processes, namely angiogenesis, arteriogenesis, and vasculogenesis, which are involved in the development and progression of diseases such as cancer growth/metastasis, proliferative retinopathy, and atherosclerosis, and in the process of normal physiological phenomena such as embryonic development, wound healing, corpus luteum, and placenta formation process. For its mechanism and control, hypoxia-inducible factor (HIF-1), which is a transcriptional activator stabilized in a hypoxic state due to disruption of blood flow, plays an important role. Neovascularization has been elucidated to be promoted/suppressed by various growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), platelet-derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), angiopoietin (Ang) and its receptors, adhesion molecules such as vascular endothelial (VE) cadherin, and enzymes. On the basis of these findings, treatments aimed at revascularization in ischemic heart disease and severe lower limb ischemia were applied on a global scale. Recently, vasculogenesis has been shown to occur newly from vascular endothelial progenitor cells (EPC) present in the bone marrow and circulating blood, and is used as a cell source for revascularization therapy in many clinical studies. In this article, we describe the basic concepts of neovascularization, revascularization therapy using peripheral blood stem cells for severe limb ischemic disease, and myocardial regeneration therapy, as well as the trial of EPC amplification for enhancing the therapeutic effect and future prospect.

Key Words: neovascularization, endothelial progenitor cell, mesenchymal stem cell, HIF-1, pyruvate

## はじめに

新たな血管形成（広義の血管新生：Neovascularization) は， 個体発生の過程や損傷した組織の修復,黄体や胎盤の形成過程などの正常な生理的現象の場合のみならず，悪性腫瘍の増殖・転移，増殖性の網膜症，アテローム性動脈硬化症など疾患の発症・進展に関与していることが知られている1).そのメカニ
ズムおよび制御には様々な増殖因子とその受容体,接着分子や酵素等が関わり，血管形成を促進・抑制 していることが解明されてきている2). それらの研究成果をもとに, 虚血性心疾患, 重症下肢虚血症に対 する血管再生を目的とした治療が世界規模で行われ ている ${ }^{3 \sim 5)}$. 本稿では, 広義の血管新生の基本概念と,本学でも行われた重症四肢虚血疾患に対する末梢血
幹細胞を用いた血管再生治療を紹介し，今後の展望 について述べる.

## 血管新生の定義と分類

広義の血管新生 Neovascularization のプロセスに は, (1)（狭義の）血管新生 Angiogenesis, (2)動脈新生 Arteriogenesis, (3)脈管新生 Vasculogenesis $の 3$ つの機序が存在することが知られている ${ }^{116)}$. これら のうち, Angiogenesis と Vasculogenesis は新たな 血管の発生を伴うが，Arteriogenesis は既存の小動脈の発達過程を意味し, 血管再構築 Vascular remodeling の過程である. 実際に血管形成が行われて いる組織では，3つの機序が複合して生じているも のと考えられる (Fig. 1).

## 1. 血管新生 Angiogenesis

心筋梗塞，末梢血管疾患，脳卒中等により組織が虚血に陥ると, 周辺の酸素濃度低下により転写活性化因子である低酸素誘導因子（HIF-1 $\alpha$ ) の発現が増強する。 その結果 HIF-1 $\alpha$ の標的遺伝子である血管内皮成長因子 (VEGF), 血小板由来成長因子 $\mathrm{B}$ (PDGFB), 胎盤成長因子 (PGF), アンギオポエチン (Ang) 1 および 2, マトリックスメタロプロテイナー ゼ（MMP）2 および 3 のような多数の血管形成义 ディエーターの発現が直接または間接的に誘導さ れ，血管内皮細胞 (VE) カドヘリンなどの接着分子 と協働し, 既存の脈管構造からの血管内皮細胞の増殖・遊走の結果, 新しい毛細血管形成をもたらす。 その結果血流は 2 3 倍程度に増大すると考えられ ているマ).

## 2. 動脈新生 Arteriogenesis

動脈が閉塞すると, 閉塞部位の近位の側枝と遠位

Fig. 1 Neovascularization in an adult patient. Formation of new vessels in adulthood is the result of three processes, namely angiogenesis, arteriogenesis, and vasculogenesis. VEGF indicates vascular endothelial growth factor; and BMEPC, bone marrow derived endothelial progenitor cell.

を接続している既存の小動脈への血流が圧力勾配に より増大する。少の結果，血管内腔の血管内皮細胞 は血流の機械的刺激，すなわち剪断応力刺激により 細胞間接着分子である platelet and endothelial adhesion molecule-1 (PECAM-1) あるいは VE-カドへ リンを発現し，細胞内ではホスファチジルイノシ トール 3 キナーゼ (PI3-K) -Akt, 細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）シグナルの立進などによる活性化が起こり，血小板由来増殖因子（PDGF）および VEGF3, 6 を含むいくつかの増殖因子や CXC ケモ カインの放出をもたらす8．それらとともに，単球の 集積やマクロファージへの分化，より多くの単球を 誘導する単球化学誘引タンパク質 1 (MCP-1), 小動脈が発達しやすい炎症環境を提供する腫瘍壊死因子 (TNF) $-\alpha$, 内皮細胞および平滑筋細胞の増殖因子で ある塩基性線維芽細胞増殖因子 (b-FGF)，および古 い動脈構造を改造し側副動脈の拡張に必要な空間を 創出する MMP などが作用し血管の再構築が起こ る9). その結果，虚血を補うに十分な太さの側副血行路の形成・成長を促し, 組織への血流を 20～30 倍に 増大させる ${ }^{10}$ ．新生動脈のみが閉塞動脈を置換する ことができ，虚血組織において血管新生によって生成される毛細血管の機能は，主に細胞破片を除去す ることであって, 組織灌流には寄与しないと考えら れている ${ }^{11}$. 動脈形成は虚血部位から遠く離れた部位でも観察されることから，血管新生とは異なり，低酸素刺激に依存しないと考えられている9).

## 3. 脈管新生 Vasculogenesis

血管新生 Angiogenesis が既存の血管から新たな 血管を形成するのに対し, 脈管新生とは血管内皮前駆細胞 (endothelial progenitor cell：EPC) から新た な血管が発生する現象を指し, 従来は胎生期の初期 の新生血管形成に限られ，その後は血管新生，動脈新生のみが行われていると考えられていた.しかし，近年, 成人の循環血液中に EPC が存在し, 脈管新生 が行われていることが示され，末梢血単核球を用い た血管新生療法の発展に繋がった年).この現象には 上記サイトカインに加え，ストローマ細胞由来因子 （SDF-1 $\alpha$ ）とその受容体である CXCR4 などのケモ カインの関与が考えられている ${ }^{13)}$.

## 腫瘍による血管新生と抗血管新生阻害剤 がんの成長過程において, 腫瘍血管は酸素や栄養 を供給し，遠隔転移の経路になっている。がん細胞 は腫瘍血管新生を誘導するために VEGF, b-FGF, ア ンギオポエチン, 肝細胞増殖因子(HGF), EGF, PGF
などの因子を産生し，自らの増殖と遠隔転移を可能 にしている ${ }^{1415}$. 血管新生阻害療法は, 腫瘍血管を標的にし, その新規の誘導や既存の腫瘍血管の崩壊に より，がん細胞への酸素や栄養供給経路を遮断する 治療法である ${ }^{16}$. VEGF 抗体であるべバシズマブが, がん化学療法薬との併用により転移性大腸がんに対 して有用性を示すことが報告されて ${ }^{17}$ ，非小細胞肺が んおよび腎細胞がんにも適応が拡大された. その後, VEGF 受容体チロシンキナーゼ阻害薬 (VEGFRTKI)であるスニチニブ, ソラフェニブが, 単剤療法 として腎細胞がんや肝細胞がんに有用性を示し，さ らに新たな低分子阻害薬の臨床試験が進行してい る $^{18}$.

## 血管新生と間葉系幹細胞

骨髄は成体における造血の主たる場所であるが，現在では造血以外の機能も有することが知られてい る。骨髄中の細胞の 99 \%以上は血球系細胞である が, 1 \%未満は血球系以外の細胞が存在する.これら の細胞は培養血に付着する性質を持ち, 骨髄スト ローマ細胞 (bone marrow stromal cells : BMSC) と 呼ばれてきた. BMSC は血球系細胞の増殖や分化を 促すため，多彩なサイトカインや細胞増殖因子を分泌することが知られている。近年，この BMSC 中に 多分化能を有する間葉系幹細胞 (mesenchymal stem cell：MSC) ${ }^{19}$ が存在することが報告され，骨，軟骨，脂肪に加えて血管，心筋細胞にも分化するこ とが明らかとなった20). さらに MSC は胚葉の壁を超 えて神経細胞や肝細胞などへの分化も確認されてい る ${ }^{21}$ (Fig. 2)，BMSC は均一な集団ではなく, 分化段階の異なる細胞の集合体であり，この中で多分化能 を持つ細胞のみを選択することが可能であれば，さ まざまな臟器再生の強力な細胞源となると考えられ る.

## 血管内皮前駆細胞の発見

血管幹細胞 (hemangioblast) と造血幹細胞 (hematopoietic stem cell : HSC）は発生学的に共通の中胚葉細胞から分化していると考えられており，共通し た細胞表面抗原マーカーを有すると考えられてい $た^{22)} .1997$ 年 Asahara ら ${ }^{12}$ は, 成人の末梢血単核球成分から CD34 陽性細胞を分離し, VEGF 等と培養し たところ，血管内皮細胞に分化しうることを発見し た。いわゆる EPC と考えられるその細胞は, 細胞表面抗原の解析によりCD34, CD31 (PECAM-1), CD133 (ACI33), Flk-1 (VEGFR-2), Tie-2, VE-カド ヘリンなどの血管内皮細胞マーカーを発現し，新た

Fig. 2 Adult and mesenchymal stem cells (MSCs). Bone marrow stromal cells are known to secrete various cytokines and cell growth factors to promote the proliferation and differentiation of hemocytes. MSC possessing pluripotency is present in this bone marrow stromal cell and can differentiate into cardiomyocytes, bone, cartilage, and fat. NSC; neural stem cells, HSC; hematopoietic stem cells, MSC; mesenchymal stem cells.

に血管が形成されつつある局所に取り达まれ，分化・増殖・遊走し，血管形成に関与することが証明 された。それまでは発生期, 胎览期にのみ起こって いると考えられていた脈管新生 Vasculogenesis が 骨髄由来の末梢血中に存在する EPCによって成体 でも起こり得ることが証明されたことで，血管再生療法における EPC の応用が進められることとなっ た.

## 1. 血管再生療法

閉塞性動脈硬化症やバージャー病など，慢性的な 動脈閉塞による虚血が下肢に生じる病態を虚血肢と 呼ぶ，運動時に痛みが生じ，休止すると回復する間歇性跛行の状態から重症になると安静時にも持続的 な疼痛が生じる，虚血によって下肢先端部が潰瘍や 壊死に陥り, 切断術の適応になるため, 罹患者の quality of life (QOL) は著しく低下する。この重症虚血肢（critical limb ischemia：CLI）に対する治療に は, 血管拡張剤・血小板凝集抑制剂，経皮的血管形成術・バイパス術，血管リハビリテーションなどが あるが, これらの標準治療に抵抗性の CLIに対して 患者自身の EPC を下肢筋肉内直接投与する再生医療が開発された（Fig. 3).これを血管再生療法と呼 び，平成 28 年 12 月 1 日時点で第 2 項先進医療（先進医療 A) に取り上げられている 40 種類の先進医療技術のなかで,「骨䯣細胞移植による血管新生療法」,「末梢血幹細胞による血管再生治療」および「末梢血単核球移植による血管再生治療」の 3 項目が揭載されている (Table 1)。血管再生療法の対象は Fontaine 分類 III 度, IV 度 (Table 2) の慢性重症下肢虚血患者で，血管形成術やバイパス手術など他の 治療法の適応にならない重症例である。さらに現在 CD34 陽性細胞を使った血管再生医療が先端医療セ ンター病院（神戸市）において，新規の医療機器と して薬事承認を得るため医師主導治験が終了し, 近 く企業治験が開始される予定である ${ }^{23}$. 顆粒球コロ ニー刺激因子 (G-CSF) の皮下投与により骨髄から動員された EPC を含む単核球をアフェレーシスで採取したのちに, 磁気ビーズで標識した抗 CD34 抗体 によって CD34 陽性細胞を分離する。生理食塩水で 懸濁した CD34 陽性細胞を腰椎麻酔下で虚血下肢筋肉内へ局所投与する. CD34 陽性細胞中には $\mathrm{EPC}$ が豊富に含まれており,局所投与された EPC は虚血組織において一部は生着し血管内皮細胞へと分化・増殖し, 脈管新生 Vasculogenesis が起こり虚血の改善をもたらすと考えられている 2 . $\mathrm{EPC}$ そのものに よる血管新生に加えて，移植された $\mathrm{EPC}$ における VEGF, b-FGF, HGF, インスリン様成長因子(IGF)1, SDF-1 などの血管新生因子やサイトカインの発現 (paracrine 効果) も報告されている ${ }^{24}$.

Table 1 Clinical application of regeneration therapy for cardiovascular diseases

*As of December 1, 2016.

ASO; arteriosclerosis obliterans, PB; peripheral blood, HSC; hematopoietic stem cell, MNC; mononuclear cell, EPC; endothelial progenitor cell, IBRI; institute of biomedical research and innovation.

Table 2 Clinical classification of limb ischemia (Fontaine classification)

## 2. 心筋梗塞後の慢性心不全に対する心筋再生療法

心筋梗塞後の重症慢性心不全患者は心臟移植の対象となるが，ドナー不足が深刻であり，補助人工心臓を用いて待機することを余儀なくされているのが 現状である。この病態に対して, 患者自身の骨格筋 から細胞シートを作成して心筋に直接移植する再生医療が開発され，企業治験を経て再生医療等製品と して保険収載された。患者骨格筋組織を企業内細胞培養施設で増幅培養し, 凍結状態で医療機関内細胞加工施設 (CPC) に持ち込み, 移植前 3 日間 $\mathrm{CPC}$ で細胞シート化する。

この骨格筋芽細胞シートを用いた再生医療は，貼 り付けた骨格筋芽細胞シートからのサイトカインが 心機能改善に寄与していると考えられており，一部 の患者では左心室機能の改善が認められていないこ とから，将来的には心筋細胞自体を補充するための 細胞療法を併用する必要が考えられている25). その 場合の細胞ソースとしては骨髄細胞や心筋幹細胞, さらには iPS（induced pluripotent stem cells）細胞 の応用などが期待されている.

Fig. 4 HIF-1 $\alpha$ is post-translationally regulated by HIF-PH and pVHL. Under normoxia, HIF-PH hydroxylates proline residues of HIF-1 $\alpha$, resulting in the degradation of HIF-PH by pVHL-related ubiquitin-proteasome pathway. HIF-1 indicates hypoxia-inducible factor 1; HIF-PH, HIF prolylhydroxylase; and pVHL, product of the von Hippel-Lindau gene.

## 低酸素刺激およびピルビン酸による血管内皮前駆細胞の増幅

組織が低酸素状態に陥ると転写活性化因子である 低酸素誘導因子（HIF-1）が活性化される. HIF-1 は HIF-1 $\alpha$ と HIF-1 $\beta$ のへテロダイマーであり ${ }^{262727}$, HIF-1 $\alpha$ は恒常的に合成されているが, 通常の酸素状態ではユビキチン化によるプロテアソーム分解を受 けやすく，その転写活性は低く抑えられている。低酸素状態になるとポリユビキチン化に関わっていた プロリルヒドロキシラーゼ (HIF-PH) や von HippleLindau (VHL) タンパクの活性が低下することによ り HIF-1 $\alpha$ が安定化し，その標的遺伝子である VEGF, PDGFB, b-FGF などの発現を誘導し血管形成を促進する (Fig.4)，そこで，EPCを含むと考え られている骨髄細胞や末梢血幹細胞, 単核球を低酸素状態で培養することにより血管形成効果の堌強が 試みられた. Akita ら ${ }^{28}$ は末梢血単核細胞 (PBMNC) を 7 日間の低酸素条件で培養することで，より多く の EPC が誘導されることを示し, 培養上澄中により 多くの VEGF が分泌され, 片側後肢虚血のヌード ラットモデルにおいて，正常酸素で培養した場合に 比べて血流の改善効果が良好であることを示した。

Kubo ら ${ }^{29}$ は，低酸素プレコンディショニング $(24$時間の $2 \%$ 酸素濃度での培養) が, 酸化ストレス耐性機構を介して, PBMNC の生存㧍よび血管新生効力を増加させることを示した．その後同様の低酸素処理が EPC の増幅, 血管再生療法に応用されるよう になった。通常の酸素状態にある細胞では, 解糖系と酸化的 リン酸化によって 1 分子のグルコースから 38 分子 のATP が産生されるが，組織が虚血に陥り低酸素状態になると嫌気的解糖系による 2 分子の ATP し か産生されない. 低酸素環境下で安定化した HIF-1 $\alpha$ が嫌気的解糖系による ATP 産生を充進させる働き が存在することが明らかになっている. HIF-1 の標的遺伝子のひとつである glucose transporter 1 （GLUT1）は細胞内へのグルコースの取り込みを増大させ, 低酸素環境下における $\mathrm{EPC}$ による血管新生 を立進させると考えられる30.

2-オキソグルタル酸は HIF-PH の重要な補因子で あるが, 解糖系の代謝産物であるピルビン酸は HIFPH の 2-オキソグルタル酸結合部位に相似性を有 L, 競合的に HIF-PH を不活性化してその結果 HIF$1 \alpha$ が安定化する ${ }^{31}$. HIF-1 $\alpha$ が安定化することで VEGF が誘導されるため, ピルビン酸が骨髄単核細胞 (BMMNC) における VEGF 発現を増強すること が期待された. 我々は, マウス BMMNC のピルビン 酸添加培養を行い, $\mathrm{EPC}$ 表面マーカーである $\mathrm{CD} 34^{+} / \mathrm{CD} 31^{+}$二重陽性細胞が $5 \mathrm{mM}$ ピルビン酸に より最も高くなり, VEGF 遺伝子発現量は 2 日間の 培養により培養前の 27.8 倍にまで達することを示 した. さらに培養液中 VEGF 濃度は $5 \mathrm{mM}$ ピルビン 酸，4日間培養にて有意な上昇を認めた232. 本来, HIF-1 $\alpha$ は低酸素状態で安定化するが, 高濃度のピル ビン酸を添加し培養することで, 好気的環境でも EPC における HIF-1 $\alpha$ の安定化をもたらし，その標
的遺伝子である GLUT1 やVEGF の発現を亢進さ せ， $\mathrm{EPC}$ の増幅をもたらすと考えられた．ピルビン 酸は細胞のエネルギー代謝上必須の有機酸であり，無害で安価のため, 今回開発した EPC の体外増幅法 を利用して，従来投与されていた CD34 陽性細胞に 比べて, より多くの $\mathrm{EPC}$ を増幅し投与することが可能となり, 血管再生療法に応用出来ると期待される.

## おわりに

血管新生の基本概念と血管再生医療の現状，およ び今後の可能性について概説した. 個体発生や組織 の修復における血管新生と分化の分子機構の理解が 進み, 種々の疾患に対する血管再生療法への応用が 進んでおり，その有効性や安全性には一定に評価が 与えられている. また, 癌の増殖や進展, 転移にも 血管新生が重要な役割を果たすことが解明されてき ており, 実際に大腸癌や胃癌, 肺癌において血管新生を抑制し増殖を抑制する治療薬としてVEGF や VEGF レセプターに対するモノクローナル抗体や 低分子阻害薬などが臨床応用されている. 今後, ア テローム硬化症や血管新生緑内障などの非腫瘍性疾患にも応用されるものと思われる.

EPC が骨髄や末梢血中および臍帯血中 ${ }^{33}$ にも存在 することが明らかとなったことで，血管再生療法が より普及するきっかけとなったが，その機序につい て, 実際は EPC が直接血管や心筋に分化し再生する 可能性は低いと考えられている ${ }^{34)}$. また, どの細胞 ソースが最も優れているのか，どのマーカーをもつ 細胞集団が最も血管再生効果に優れているのか, $\mathrm{EPC}$ を増幅する適切な培養条件や因子は何か, 未解明な部分も多い. 今後の基礎・臨床研究の進展が望 まれる。

開示すべき利益相反はない.

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